羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷涂层的体外细胞毒性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.34.010

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (34): 5466-5472.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.34.010

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羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷涂层的体外细胞毒性

康雯¹，徐国强²，迪丽努尔·阿吉²，魏琴³，马慧¹，李兆鹏⁴，宋倩¹，茹菲娅·祖拉提¹，阿丽娜·阿布都吉力力¹，排黑尔丁·凯赛尔¹

¹新疆医科大学第一附属医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；²新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；³新疆医学动物模型研究实验室(自治区重点实验室)，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；⁴新疆五家渠市卫生局，新疆维吾尔自治区五家渠市 831300

修回日期:2014-07-12 出版日期:2014-08-20 发布日期:2014-08-20
通讯作者: 徐国强，新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054 迪丽努尔?阿吉，新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:康雯，女，1989年生，陕西省清涧县人，新疆医科大学在读硕士，主要从事口腔修复学研究。
基金资助:
新疆医学动物模型研究重点实验室开放课题项目基金(XJDX1103-2011-08)；新疆维吾尔自治区自然科学基金青年科学基金项目(2013211B59)；新疆医科大学第一附属医院青年科研专项基金(2011QN03)

In vitro cytotoxicity of the hydroxyapatite/barium titanate biological piezoelectric ceramic coating

Kang Wen¹, Xu Guo-qiang², Diilnur Aji², Wei Qng³, Ma Hui¹, Li Zhao-peng⁴, Song Qian¹, Rufiya Zulati¹, Alina Abdujilil¹, Pahirdin Kaisar¹

¹ First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ²Department of Prosthodontics, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ³Xinjiang Laboratory of Animal Models (Key Laboratory of Xinjiang Uygur Autonomous Region), Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ⁴Health Bureau of Wujiaqu, Wujiaqu 831300, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Revised:2014-07-12 Online:2014-08-20 Published:2014-08-20
Contact: Xu Guo-qiang, Department of Prosthodontics, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China Diilnur Aji, Department of Prosthodontics, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Kang Wen, Studying for master’s degree, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Open Project Fund of Xinjiang Laboratory of Animal Models (Key Laboratory of Xinjiang Uygur Autonomous Region), No. XJDX1103-2011-08; the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2013211B59; the Youth Scientific Research Fund of the First Affiliated Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2011QN03

摘要/Abstract

摘要：

背景：为优化羟基磷灰石的生物活性，前期实验利用等离子喷涂技术在羟基磷灰石表面等离子喷涂制备了压电陶瓷涂层，但此种新型材料的细胞毒性还不明确。

目的：评价羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷涂层的体外细胞毒性。

方法：将第3代比格犬骨髓间充质干细胞分别接种于羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷试件与羟基磷灰石试件上，接种5 d后，扫描电镜观察材料上细胞黏附情况。分别以羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷试件浸提液、羟基磷灰石试件浸提液、含5%二甲基亚砜和体积分数15%胎牛血清的低糖DMEM溶液、只含体积分数15%胎牛血清的低糖DMEM培养基培养第3代比格犬骨髓间充质干细胞，培养的1，3，5 d采用CCK-8法检测各组细胞毒性。

结果与结论：骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷试件与羟基磷灰石试件表面增殖旺盛，达到复层生长，伪足与细胞之间连接很紧密，胞体丰富，表明两组材料具有良好的细胞相容性。CCK-8细胞毒性实验显示，羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷试件与羟基磷灰石试件组细胞相对增殖率均在80%以上，毒性分级为1级，无细胞毒性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词:

生物材料, 材料相容性, 钛酸钡, 压电陶瓷, 细胞毒性, 生物相容性, CCK-8, 等离子喷涂, 骨髓间充质干细胞, 羟基磷灰石, 扫描电子显微镜, 新疆维吾尔自治区自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: In order to optimize the biological activity of hydroxyapatite, previous experiments have used plasma spraying technique to prepare a piezoelectric ceramic coating on the surface of hydroxyapatite, but the cytotoxicity of this new material is not clear.

OBJECTIVE: To evaluate the cytotoxicity of hydroxyapatite/barium titanate biological piezoelectric ceramic coating in vitro.

METHODS: The 3^rd generation beagle bone marrow mesenchymal stem cells were seeded on hydroxyapatite/barium titanate piezoelectric ceramic specimens and hydroxyapatite specimens, respectively. After 5 days, the cell adhesion was detected by scanning electron microscopy. The 3^rd generation bone marrow mesenchymal stem cells were also co-cultured with hydroxyapatite/barium titanate piezoelectric ceramic specimen extract, hydroxyapatite specimen extract, low-glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium containing 5% dimethylsulfoxide and 15% fetal bovine serum, and low-glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium containing 15% fetal bovine serum, respectively. The cytotoxicity was tested by Cell Counting Kit-8 assay at days 1, 3, 5 after co-culture.

RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow mesenchymal stem cells on the surface of hydroxyapatite/barium titanate piezoelectric ceramic specimens and hydroxyapatite specimens grew proliferatively and presented with multi-layer growth. The connection between cells and pseudopodia was very close, which indicates that the two kinds of materials both have good cytocompatibility. Cell Counting Kit-8 assay showed that the cells cultured in the extracts of hydroxyapatite/barium titanate biological piezoelectric ceramic and hydroxyapatite specimens proliferated more than 80%, and the toxicity was grade 1 that meant no cytotoxicity.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

全文链接：

Key words: ceramics, materials testing, hydroxyapatites

中图分类号:

R318

康雯，徐国强，迪丽努尔•阿吉，魏琴，马慧，李兆鹏，宋倩，茹菲娅•祖拉提，阿丽娜•阿布都吉力力，排黑尔丁•凯赛尔. 羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷涂层的体外细胞毒性[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(34): 5466-5472.

Kang Wen, Xu Guo-qiang, Diilnur Aji, Wei Qng, Ma Hui, Li Zhao-peng, Song Qian, Rufiya Zulati, Alina Abdujilil, Pahirdin Kaisar. In vitro cytotoxicity of the hydroxyapatite/barium titanate biological piezoelectric ceramic coating[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(34): 5466-5472.

图/表（结果） 1

2.1 犬骨髓间充质干细胞的原代培养、传代及鉴定 最初接种的骨髓间充质干细胞呈圆形，大小不一；6 h后部分细胞贴壁，变形，混有大量造血细胞及部分细胞碎片；第3天更换培养液时，可见大量散在分布的贴壁梭形细胞和悬浮的红细胞，换液时弃去红细胞，换液后贴壁细胞基本纯化大多呈长梭形，少数呈圆形或类圆形(图1A)。第7天数量加速生长，已形成成纤维细胞样集落，大部分细胞成梭形，少数呈多角形。培养第9，10天可达到90%融合。二三天便可传代1次，传代后细胞增殖速度增快。第3代比格犬骨髓间充质干细胞见图1B所示。本实验通过细胞形态及免疫组化方法来鉴定犬骨髓间充质干细胞，显微镜下观察细胞并照相，大部分细胞免疫细胞化学染色后CD44、CD29为阳性(图1C，D)，CD34为阴性，提示所获取的细胞成分为骨髓间充质干细胞。

2.2 不同成分培养液培养的细胞形态观察

实验组：培养第1，3，5天，细胞一直保持良好的生长状态，贴壁生长情况良好，细胞均牢固黏附在培养孔底，细胞形态良好，呈典型梭形和多角形，细胞饱满。而且随着时间的延长，细胞数目也逐渐增多，第5天时细胞已经长满，未出现细胞脱落、裂解等细胞病变。

对照组：培养第1，3，5天时此组细胞大部分形态正常，与实验组细胞形态无太大差异，都呈梭形，未见死亡的圆形细胞漂浮，细胞胞浆中无气泡，也无细胞核皱缩等病变情况。与实验组一样，细胞培养时间延长，细胞数目变多。

阴性对照组：细胞保持优良的生长状态，贴壁生长状态非常好，细胞与培养孔底紧密结合细胞形态正常，呈典型梭形或多角形，细胞胞浆中无气饱，无细胞核皱缩，细胞胞质很饱满，未见死亡圆形细胞漂浮。

阳性对照组：细胞数量非常少，胞体极度皱缩或细胞溶解呈空泡状，细胞胞浆中有气泡，见大量死亡细胞漂浮。

2.3 扫描电镜观察不同试件上的细胞黏附 如图2所示，两种材料分别与骨髓间充质干细胞复合培养5 d后，可见两组细胞的突起均伸入材料孔隙内，细胞的突起形成胞间连接，大量细胞形成片状包绕材料表面，部分细胞密集区域还可见到细胞外基质的形成，且细胞大部分伸展良好。在两组表面都可观察到细胞增殖旺盛，达到复层生长，伪足与细胞之间连接很紧密，胞体丰富。由扫描电镜观察和显微镜观察均可得出等离子喷涂钛酸钡生物压电陶瓷试件与羟基磷灰石试件和比格犬骨髓间充质干细胞都有很好的细胞相容性。

2.4 CCK-8法检测羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷材料的体外细胞毒性 4组浸提液对比格犬骨髓间充质干细胞作用1，3，5 d后的A值见表1，细胞相对增殖率、毒性分级见表2。对原始数据分析，方差不齐，所以将A值做了秩变换后进行析因设计的方差分析。在不同时间点，A值有统计学差异；不同组别，A值有统计学差异；时间与组别之间有交互作用。

不同时间点之间两两比较，相互都具有统计学差异，结合各时间点的均数，可以发现随着时间推移，A值变大。不同组之间两两比较，实验组和对照组之间没有统计学差异，其余各组之间互相比较具有统计学差异，结合各组均数可以发现，阴性对照组A值最大，实验组和对照组次之，阳性对照组A值最小。因此，可以得出对照组与实验组表现出的细胞毒性无太大差异，但其两组细胞毒性大于阴性对照组，且随着培养时间的增长，实验组和对照组的细胞毒性基本趋于0级。

参考文献

[1] Smiler D,Soltan M,Lee JW.A Histomorphogenic Analysis of BoneGrafts Augmented With Adult Stem Cells.Implant Dent. 2007;16(1):42-53.
[2] Schreurs BW,Bolder SB,Gardeniers JW,et al.Acetabular revision with impacted morsellised cancellous bone grafting and a cemented cup. A 15-to-20-year follow-up.Bone Joint Surg Br.2004;86(4):492-497.
[3] Schreurs BW,Busch VJ,Welten ML,et al.Acetabular reconstruction with impaction bone- grafting and a cemented cup in patients younger than fifty years old.Bone Joint Surg Am.2004;86(11):2385-2392.
[4] 肖秀兰,陈志刚.羟基磷灰石涂层制备技术的可行性研究[J].材料导报,2003,17(4):32-34.
[5] Wang H,Eliaz N,Zhou X,et al.Early bone apposition in vivo on plasma-sprayed and electrochemically deposited hydroxyapatite coatings on titanium alloy. Biomaterials. 2006; 27(23):4192-4203．
[6] Xue WC,Tao SY,Liu XY,et al.In vivo evaluation of plasma sprayed hydroxyapatite coatings having different crystallinity. Biomaterials.2004;25(3):415-421．
[7] 蒋毅,尹光福,周大利,等.羟基磷灰石/聚乳酸复合人工骨修复材料的研究进展[J].国外医学:生物医学工程分册, 2004,27(4): 238-241.
[8] Brown RQ,Mount A,Burg KJ.Evaluation of polymer scaffolds to be used in a composite injectable system for intervertebral disc tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 2005;74(1):32-39.
[9] 武晓刚,陈维毅.骨组织电学特性及临床应用[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(7):1342-1345.
[10] Fary RE,Carroll GJ,Briffa TG,et al.The effectiveness of pulsed electrical stim ulation(E-PES)in the management of ostearthrises’ of the knee protocol for a randomized controlled trial.BMC Musculoskelet Disord.2008;9:18.
[11] Sui J,Li MS,LV YP, et al.Plasma-sprayed hydroxyapatite coatings on carbon/carbon composites.Surf Coat Tech. 2004; 176:188-192.
[12] Wei Y,WAang XX.Ribbon-like and rod-like hydroxyapatite crystals deposited on titanium surface with electrochemical method.Mater Lett.2007;61:4062-4065.
[13] Xin P,Igor Z.Electrophoretic deposition of composite hydroxyapatite-chitosan coatings.Mater Character. 2007;58: 339-348.
[14] Sun JF,Han Y,Huang X.Hydroxyapatite coatings prepared by micro-arc oxidation in Ca- and P-containing electrolyte.Surf Coat Tech.2007;201:5655-5658.
[15] Miao X,Hu Y,Liu J,et al.Hydroxyapatite coating on porous zirconia. Mater Sci Eng C.2007;27:257-261.
[16] 王迎春,季建国,周尧和.脉冲激光沉积羟基磷灰石生物陶瓷涂层的研究进展[J].金属热处理,2006,31(10):4-9.
[17] Koch CF,Johnson S,Kumar D,et al.Pulsed laser deposition of hydroxyapatite thin film.Mater Sci Eng C.2007;27:484-494.
[18] 付涛,憨勇,徐可为.溶胶-凝胶法二氧化钛薄膜诱导沉积磷酸钙层[J].硅酸盐学报,2003,31(4):402-405.
[19] 张春燕,程祥荣,蒋滔.采用仿生溶液法在纯钛表面制备羟基磷灰石涂层的研究口[J].口腔颈面修复学杂志,2003,4(1):49-51.
[20] 郑扣松,胡树兵,赵苏阳.Ti-6Al-4V合金基体等离子喷涂生物活性羟基磷灰石涂层的研究进展[J].材料导报,2006,20(Ⅵ): 366-368.
[21] 袭迎祥,王迎军.HA生物活性陶瓷涂层制备方法研究进展[J].陶瓷工程,1999,33(4):14-l 7.
[22] 陈淼,陈浩,王洪涛,等.等离子喷涂钛酸钡铅(BPT)涂层的制备及性能研究[J].科技资讯,2013,11(4):106-108.
[23] 左敦稳,张春明,王珉.等离子喷涂PZT涂层压电性能的实验研究[J].中国机械工程,2000,11(4):435-438.
[24] GB/T 16886.12-2005/IS010993—12:2002医疗器械生物学评价第12部分:样品制备与参照样品.北京:中国标准出版社,2005.
[25] Wilershausen B,Marroquin BB,Schafer D,et al.Cytotoxicity of root canal filling materials to three different human cell lines. Endod.2000:26(12):703-707.
[26] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 16886.5 -2003.医疗器械生物学评价第5部分:体外细胞毒性试验[S].北京:中国标准出版社,2003:80-88.
[27] Muthutantri A,Huang J,Edirisinghe M.Novel method of preparing hydroxyapatite foams.J Mater Sci Mater Med. 2008;19(4):1485-1490.
[28] Chuenjitkuntawom B,Inrung W,Damrongsri D,et al. Polycaprolactone/hydroxyapatite composite scaffolds: preparation, characterization, and in vitro and in vivo biological responses of human primary bone cells.J Biomed Mater Res A.2010;94(1):241-251.
[29] Dellinger JG, Cesarano J 3rd,Jamison RD. Robotic deposition of model hydroxyapatite scaffolds witll multiple architectures and multiscale porosity for bone tissue engineering.J Biomed Mater Res A.2007;82(2):383-394.
[30] Book N,Riminucci A,Dionigi C,et al.A novel route in bone tissue engineering: magnetic biomimetic scaffolds.Acta Biomater. 2010;6(3):786-796.
[31] Ma SN,Suo XB,Qiu J.Fabrication of n–SiO2 reinforced Al2O3 composites coatings on 7A52 aluminium alloy by micro–arc oxidation.Adv Mater Res.2010;97-101:1463-1466.
[32] Fini M,Torric elli P,Giavaresi G,et al.Effect of pulsed electrom agnetic field stim ulation on knee cartilage, subchondral and epyphis eal trabec ular bone of aged Dunkin Hartley guinea pigs.Biomed Pharmacother.2008;62(10):709-715.
[33] Bassett CAL,Becker RO.generation of electric potential by bone in response to mechanical stress. Science. 1962;137 (3535):1063.
[34] 武晓刚,陈维毅.骨组织电学特性及临床应用[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(7):1342-1345.
[35] 汤灵霞.骨替代材料的流动电位研究[D].天津:天津大学,2006.
[36] Wang X,Wang M,Bai R.Research current status and prospect of the stress and remodeling adaptation models in living bone tissue.Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi. 2001;18(3): 479-483.
[37] 吕宇鹏,陈艳梅,朱瑞富,等.等离子喷涂羟基磷灰石涂层的相组成及其结构[J].材料科学与工艺,2007,15(4):492-499.
[38] Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular groth and survival:Application to proliferation and cytotoxicity assays.J Immunol Methods.1983;65(1-2):55-63.
[39] Tominaga H,Ishiyama M,Ohseto F,et al.A water-soluble Tetrazolium salt useful for colorimetric cell viability assay.Anal Commun.1999;36:47-50.
[40] 熊建文,肖化,张镇西.MTT法和CCK-8法检测细胞活性之测试条件比较[J].激光生物学报,2007,16(5):459-562.
[41] 刘爱旗,夏璐. CCK-8法与MTT法检测兔成纤维细胞活性的比较[J].中国医学创新,2013,6(2):12-13.
[42] 陈冲,焦宁,徐瑞荣,等.台盼蓝拒染法、MTT法、CCK-8法在研究As2O3细胞毒性作用中的意义[J].中国医药导报, 2013,10(12): 24-26.
[43] 陈耀忠,刘根娣,宋萍,等三种比色法评价4种牙科金属材料对L-929细胞的毒性[J].中国组织工程研究, 2013,17(8): 1390-1397.
[44] 万文婷,李宁,刘静,等.CCK-8法与MTT法检测人前列腺癌PC3细胞活性的比较研究[J].时珍国医国药,2010,21(12):3046-3048.
[45] 侯春梅,李新颖,叶伟亮,等.MTT法和CCK-8法检测悬浮细胞增殖的比较[J].军事医学科学院院刊,2009,33(4):400,封3.
[46] 徐丽,张勤丽,高福平,等.几种细胞毒性评价方法在纳米氧化铝神经细胞毒性研究中的应用比较[J].中华预防医学杂志, 2010, 44(9):785-789.
[47] 秦庆华,尹承芬,董宁,等.噻唑兰法和CCK-8法检测小鼠淋巴细胞增殖反应的比较[J].感染、炎症、修复,2012,13(4):199-202.
[48] 张丹,南黎,任玲,等.CCK-8法和MTT法评价医用抗菌不锈钢细胞毒性的比较研究[J].口腔医学,2012,32(1):5-8.

引言

对于现代医学而言，临床上可用于修复骨缺损的植入材料数不胜数，但其有各自的优缺点。自体骨材料是骨替代材料的最优选择，但其供骨来源不易受患者接受，而且增加了患者的手术创伤与痛苦^[1]。同种异体骨及异种骨的种类繁多，但会引起排斥反应^[2-3]。因此，人们把目光转向人工合成骨替代材料，人工合成骨主要有羟基磷灰石、磷酸钙骨水泥等。自从20世纪70年代初，日本青木秀希和美国Jarcho等分别成功的合成人工羟基磷灰石以来，羟基磷灰石便被很好地运用于临床治疗中^[4]。羟基磷灰石作为人体和动物硬组织的主要无机物组成成分，具有很好的生物相容性和骨传导作用，可以用于骨组织缺损的修复，引导骨组织的生长，与骨组织可以形成牢固的键合，是目前公认性能良好的骨修复替代材料^[5-7]。

理想的骨缺损填充材料应同时具有骨传导性和骨诱导性，而单纯人工骨往往只能起骨传导作用，并没有骨诱导活性^[8]，且单一材料很难满足骨组织工程细胞外支架材料的要求，目前人们更期望采用多种材料复合的方法制备出有仿生学原理的材料。近年来，压电陶瓷走入了人们视野。压电陶瓷一直以来都被广泛运用于陶瓷工业，人们称它为“电子工业的支柱”^[9-10]。此种材料因具有压电性而被人们广泛应用于人体硬组织。将压电陶瓷与生物陶瓷复合制备，可将两类陶瓷的特性优化组合来模拟天然骨的无机组成和电活性特征，将会进一步优化材料的生物活性。目前应用较多的涂层制作工艺有等离子喷涂^[11]、电化学沉积^[12-14]、涂覆-烧结^[15]、激光熔覆^[16-17]、溶胶-凝胶^[18]、仿生合成等^[19]。在众多涂层制备工艺中，等离子喷涂方法是很重要的，也是制备工艺最成熟的一种方法^[20-21]。

目前课题组成功利用等离子喷涂技术在羟基磷灰石表面等离子喷涂制备压电陶瓷涂层，而一种材料要被应用于人体必须有良好的细胞相容性、血液相容性，不具有致突变、致畸、吸入毒性、致癌性及显性致死性等，在临床运用前，必须按照相关安全性检测标准进行完整的生物学评价。目前，在生物材料领域评价材料生物相容性主要有体外细胞培养法及体内植入法，而前者是评价材料生物相容性最基础、最重要的步骤。与体内植入法相比，体外细胞培养法具有对材料敏感性高、重复性好、易于控制实验条件、易于定量分析、减少动物实验等优点，它可以最快的速度和最简便的方法让人们了解细胞和受试材料接触后所发生的毒性反应。

前期已有研究证实羟基磷灰石具有良好的细胞相容性，而国内对于钛酸钡压电陶瓷的生物相容性较少报道，对于此种新型材料的生物相容性也不明确。本实验将采用CCK-8法研究羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷涂层的细胞毒性，以期为其临床应用提供一部分依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：体外细胞毒性实验，对比观察。

时间及地点：实验于2013-10-10/30在新疆医科大学第一附属医院医学动物模型研究实验室(自治区重点实验室)完成。

材料：

实验动物：6月龄健康雄性比格犬1只，体质量15 kg，由新疆医科大学第一附属医院动物模型实验室提供，许可证号：SCXK(新)2010-0001。

实验方法：

羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷试件的制备：在10 mm× 10 mm×2 mm羟基磷灰石试件表面等离子喷涂制备钛酸钡压电陶瓷涂层^[22-23]。将制备好的羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷试件及羟基磷灰石试件用提及分数75%乙醇超声振荡清洗15 min，之后再用三蒸水反复冲洗3次，烘干后⁶⁰Co辐射灭菌备用。

材料浸提液的制备：按样品表面积/浸提液= 3 cm²/mL^[24]，用含体积分数15%胎牛血清的低糖DMEM培养基分别浸提羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷试件和羟基磷灰石试件，在37 ℃、体积分数5%CO₂和饱和湿度的条件下浸提材料72 h。

比格犬骨髓间充质干细胞的原代培养、传代及鉴定：取6月龄健康雄性比格犬，全麻，无菌条件下在髂骨抽取骨髓约3 mL，置于含肝素钠的注射器内，骨髓与肝素钠比例为1∶1.5，混匀。将骨髓打入低糖DMEM培养基内，用12号针头吸取骨髓3遍，将骨髓小粒打散，制成细胞悬液，用低糖DMEM培养基洗3遍，1 000 r/min离心5 min，弃上清，在骨髓中加入5 mL含体积分数15%胎牛血清的低糖DMEM培养基(青霉素100 U/mL，链霉素100 mg/L)，于 37 ℃、体积分数5%CO₂和饱和湿度条件下无菌培养。每 3 d换液1次，在显微镜下观察细胞形态，7-10 d细胞长至培养瓶底80%-90%时，用0.125%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化，可进行传代，按1∶3的比例将细胞传至第3代，制成细胞悬液计数，调细胞浓度至2×10⁶ L^-¹备用。鉴定干细胞用免疫组织化学方法及形态学鉴定。取第3代骨髓间充质干细胞行CD44、CD29、CD34抗原检测，每种抗原分为实验组和阴性对照组，实验组采用SABC法行免疫组织化学染色，对照组与实验组不同的只是用正常兔血清代替一抗，而其余步骤与实验组相同。

扫描电镜观察干细胞在试件表面的黏附：分别取羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷试件与羟基磷灰石试件各6个，共12个放入24孔板中，每孔加入2×10⁶ L^-¹的细胞悬液1 mL。37 ℃、体积分数5%CO₂和饱和湿度条件下在无菌培养箱中培养5 d。3%戊二醛中固定，乙醇梯度脱水各15 min，醋酸异戊酯梯度处理各15 min。临界点干燥、喷金，扫描电镜观察细胞在两种材料表面的黏附情况。

CCK-8法测定试件细胞毒性：将制备好的细胞悬液接种在3块96孔培养板上。每板接种24个孔，分为4组，每组6孔，实验组每孔加入100 µL羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷试件浸提液，对照组每孔加入100 µL羟基磷灰石试件浸提液，阳性对照组每孔加入100 µL含有5%DMSO和体积分数15%胎牛血清的低糖DMEM培养基，阴性对照组每孔加入100 µL含体积分数15%胎牛血清的低糖DMEM培养基。之后将培养板置入37 ℃、饱和湿度、体积分数5%CO₂培养箱中培养。在培养的第1，3，5天各取出1块培养板，每孔加入CCK-8试剂10 µL，继续置入CO₂培养箱中避光孵化4 h。

在酶联免疫检测仪上选择450 nm波长测定每孔细胞吸光度(A)。根据以下公式计算细胞相对增殖率，细胞相对增殖率(%)=(实验组A/阴性对照组A)×100%。

根据细胞相对增殖率判断细胞毒性等级，可评定材料毒性程度^[25]：细胞相对增殖率为0时为Ⅴ级，1%-24%为Ⅳ级，25%-49%为Ⅲ级，50%-74%为Ⅱ级，75%-99%为Ⅰ级，≥100%为0级。0级、1级无细胞毒性，2级为轻度细胞毒性，3级、4级为中度细胞毒性，5级为重度细胞毒性。

根据细胞形态学变化评价细胞毒性^[26]：细胞形态正常，呈梭型或不规则三角形，贴壁生长良好，无毒；细胞贴壁生长好，可见少数细胞圆缩，偶见悬浮细胞，为轻度毒性；细胞贴壁生长不佳，细胞圆缩1/3以上，见悬浮死细胞，为中度毒性；细胞基本不贴壁，90%以上为悬浮死细胞，为重度毒性。

主要观察指标：不同时间点各组细胞形态变化、相对增殖率、毒性分级及黏附情况。

统计学分析：利用SPSS 19.0软件完成统计处理，行析因设计方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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讨论

骨缺损的临床发生率一直居高不下，仅次于输血，因此骨组织工程研究开发新型骨组织移植替代材料成为了近年的主要发展方向^[27-30]。作为骨骼或牙齿的诱导因子，羟基磷灰石在口腔领域中应用广泛，其作为骨替代材料，不但具有良好生物相容性和生物活性，还具有优异的骨传导性能，但其骨诱导活性低，所以近年来对羟基磷灰石的改性一直是热点。

Fukada和Yasuda首先提出骨具有压电性，他们发现对骨施加物理外力时，应变可在骨的内部产生电位变化^[31-32]，1962年Bassett^[33]通过实验进一步证实骨具有压电效应。Damask首次通过实验发现对骨施加10⁷ N/m²力，可产生10 Mvd的电流。电位变化可引发细胞和细胞外环境反应，最后导致骨组织生长。现在电流能刺激骨生长已被公认，并且取得了很好的疗效^[34]。骨具有压电性决定了骨的塑形和改建^[35]。

而压电陶瓷这一新型功能性陶瓷具有与骨相似的压电效应，即某些各向异性的晶体，在外力作用下产生形变，使正负电荷重心偏移而极化，陶瓷内存在剩余极化强度并以偶极矩的形式表现出来，受力作用后会产生放电效应，即将机械能转化为电能，即可以利用患者的咀嚼运动，使其对牙槽骨产生微电流刺激。Wang等^[36]首先提出压电陶瓷/聚合物复合材料的概念，这对以后的理论、性能、制备工艺及应用开发等研究方面都有很大影响^[37]。陈冶清课题组对压电陶瓷钛酸钡和磷酸三钙掺杂混合进行了研究，其结果显示该压电陶瓷材料与骨组织的生物相容性良好，能够促进成骨细胞的增殖活性，材料的力学性能亦能满足要求，尤其在与骨组织的压电性能相匹配方面展现了其优势。

钛酸钡压电陶瓷是一种新型的功能性陶瓷，它具有高的稳定压电性能。本实验在医疗领域运用广泛的羟基磷灰石材料上等离子喷涂具有压电效应的钛酸钡生物压电陶瓷涂层，此种复合材料可以综合羟基磷灰石与钛酸钡压电陶瓷的长处，特性优化组合模拟天然骨的无机组成和电活性特征，进一步提高了材料的生物活性，因为其不含铅，所以为其在临床运用提供了一定可行性，但目前国内对于钛酸钡的细胞毒性报道相对较少。

CCK-8是一种综合指标较好的细胞活性检测试剂，其检测原理与常用的MTT法略有不同，检测条件也完全相同。MTT能够被活细胞的线粒体脱氢酶还原为难溶于水的蓝紫色产物一甲瓒晶体，该结晶可被二甲基亚砜溶解，通过酶标仪测量该细胞液的吸光度值，便可检测出待测细胞样品的活性，晶体生成的量与活细胞数量和细胞活化状态呈线性关系^[38]。CCK-8试剂中含有WST-8，其化学名称为2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2，4-disulfophenyl)-2H。WST-8在电子载体的作用下能被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒物^[39]，生成的甲瓒物数量与活细胞数量呈正比，通过酶标仪测量细胞液的吸光度值，便可检测出待测细胞样品的活性。在MTT法中，由于反应所生成的甲瓒晶体沉淀，需要使用适当的裂解液溶解后才能测出细胞的吸光度值，不同裂解液的溶解能力及其产生的背景信号对吸光度值的测量结果具有较大影响，这是一种系统误差，而实际操作中也容易由于在吸取上清时可能会带走部分细胞，而导致偶然误差。而在使用CCK-8试剂时，由于生成的甲瓒物具有高度水溶性，不需要使用裂解液溶解沉淀，同时也不需要吸取上清，不容易造成细胞的丢失，因而数据稳定^[40-48]。所以相对于常用的MTT法来说，CCK-8法是一种快速、灵敏度较高、重复性好、国际认可度高的细胞活性检测方法。

显微镜下阳性对照组细胞膜结构不清晰且不平滑，细胞膜颜色变深，且细胞数量明显比其他几组少。阴性对照组细胞的细胞膜结构完整，细胞膜与细胞质清晰可见，与阳性对照组相比，羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷组和羟基磷灰石组的细胞膜清晰平滑，细胞保持良好的生长状态，呈典型梭形和多角形，细胞饱满，提示其细胞相容性良好。

在CCK-8实验中将羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷材料和羟基磷灰石浸提液与犬骨髓间充质干细胞共培养，进行一系列连续时间点监测更能实际反映时间变化对细胞相对增殖率的影响。由实验得出羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷材料对比格犬骨髓间充质干细胞的生长无明显毒性，不影响细胞的正常增殖，且与单纯羟基磷灰石试件的细胞毒性无太大差异。随着培养时间的延长，羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷试件和单纯羟基磷灰石试件的细胞相容性都逐渐转好。细胞毒性评定为羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷材料组为1级，羟基磷灰石材料组为1级，阳性对照组毒性为4级，阴性对照组为0级，符合GB/T14233.2-2005规定，细胞毒性在0级和1级为合格。

为进一步了解骨髓间充质干细胞与两种材料的复合情况，采用了扫描电镜进行观察，发现细胞与两种材料黏附良好，表现出分泌基质的生物学行为。由此更加说明羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷材料具有和羟基磷灰石一样优异的细胞相容性，两种材料基本无细胞毒性。

虽然本实验得出该复合材料在体外有比较低的细胞毒性，但其在体内的影响还不能就此作出推论。利用电流电场刺激成骨治疗骨折，虽然有很大的临床意义，但电场可能对于人体的损害也是不能忽视的。该新型材料在体内的植入实验及长期电刺激是否能够引起体内的骨肿瘤或其他疾病仍然需要人们去完善。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷涂层的体外细胞毒性

In vitro cytotoxicity of the hydroxyapatite/barium titanate biological piezoelectric ceramic coating

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[1]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[2]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[3]	梁学奇, 郭黎姣, 陈贺捷, 武杰, 孙雅琪, 邢稚坤, 邹海亮, 陈雪玲, 吴向未. 泡状棘球绦虫原头蚴抑制骨髓间充质干细胞向成纤维细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 996-1001.
[4]	耿瑶, 尹志良, 李兴平, 肖东琴, 侯伟光. hsa-miRNA-223-3p调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1008-1013.
[5]	伦志刚, 金晶, 王添艳, 李爱民. 过氧化物还原酶6干预骨髓间充质干细胞增殖及体外向神经谱系诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1014-1018.
[6]	朱雪芬, 黄成, 丁健, 戴永平, 刘元兵, 乐礼祥, 王亮亮, 杨建东. 胶质细胞神经营养因子诱导骨髓间充质干细胞向功能性神经元分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1019-1025.
[7]	裴丽丽, 孙贵才, 王弟. 丹酚酸B抑制骨髓间充质干细胞氧化损伤及促进分化为心肌样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1032-1036.
[8]	陈俊毅, 王宁, 彭称飞, 朱伦井, 段江涛, 王烨, 贝朝涌. 脱钙骨基质与慢病毒介导沉默P75神经营养因子受体转染骨髓间充质干细胞构建组织工程骨[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 510-515.
[9]	刘江锋. 纳米羟基磷灰石/聚酰胺66复合材料联合锁定钢板治疗股骨骨纤维异常增殖症[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 542-547.
[10]	孙建威, 杨新明, 张瑛. 孟鲁司特联合骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤模型大鼠[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3962-3969.
[11]	张立书, 刘安琪, 何小宁, 金岩, 李蓓, 金钫. Alpl基因影响骨髓间充质干细胞治疗溃疡性结肠炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3970-3975.
[12]	郝晓娜, 张英杰, 李玉云, 许涛. 过表达脯氨酰寡肽酶的骨髓间充质干细胞修复肝纤维化模型大鼠[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3988-3993.
[13]	姜涛, 马磊, 李志强, 寿玺, 段明军, 吴硕, 马创, 魏琴. 血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3937-3942.
[14]	刘利永, 周雷. 组织工程用水凝胶研发现状和发展趋势：基于专利信息的分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3527-3533.
[15]	何林, 吴稀, 何淞, 杨森. 经聚多巴胺涂层的羟基磷灰石生物陶瓷具有亲水性与细胞黏附性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3540-3544.